摘 要 以双芴甲氧羰基赖氨酸(Di-Fmoc-Lysine)为支化单元采用固相多肽合成技术制备了一种树枝状聚赖氨酸.该聚合物表面活性氨基通过与芴甲氧羰基苯丙氨酸(Fmoc-Phe)反应获得表面完全替代的苯丙氨酸改性树枝状聚赖氨酸.产物的分子量和结构经MS和NMR进行了表征.研究结果表明，利用该方法得到的产物分子量单一，是一种潜在的理想非病毒治疗载体赖氨酸。
关键词 非病毒载体赖氨酸，树枝状，多聚赖氨酸，表面改性
随着基因治疗技术的发展，非病毒类载体在近期的研究中越来越受到了广泛的关注[1-3].目前，处于临床实验的基因治疗病历中有近四分之一采用了非病毒基因治疗载体，这些载体主要包括脂质体、裸DNA等.作为研究中常用的一类非病毒基因运载手段，聚合物载体多以正离子聚合物为主并通过其上氨基所带的正电荷与DNA负电荷间的静电引力使DNA分子缩合成高稳定性、小粒径的复合物(polyplex).这种由静电作用而引发的缩合一直被视为质粒跨膜运输的主要手段.但作为一类非病毒载体，聚合物载体虽多见于实验室研究中，其在临床上的应用仍鲜有报道.造成这种情况的主要原因之一在于目前所广泛采用的线性正离子聚合物往往存在着一定的分子量分布，造成了其代谢途径和毒性的差异和不确定性,从而限制了其在临床上的应用.而树枝状聚合物以其规则的支化单元、独有的合成方式避免了上述的问题，展现出巨大的医学应用潜力.Denkewalter等率先从N,N*-双叔丁氧羰基赖氨酸出发采用液相合成技术获得了树枝状聚赖氨酸.由于其优良的生物相容性，树枝状聚赖氨酸受到了广泛地重视，并被应用于细胞转染过程.近来病毒生理学的研究成果显示，病毒基因组在病毒包装过程中的缩合是一个多种作用力驱动的结果.有鉴于此，一些研究组相继开发了基于非静电作用转染策略的聚合物载体赖氨酸。
本文从赖氨酸出发赖氨酸，合成了Nα,N*-双芴甲氧羰基赖氨酸(Di-Fmoc-Lysine)单体，进而利用固相多肽合成方法制备获得3代树枝状聚赖氨酸(poly(lysine)dendrimer generation 3,PL dendrimer G3).通过该聚合物表面的活性氨基与芴甲氧羰基苯丙氨酸(Fmoc-Phe)反应可获得苯丙氨酸封端的PLdendrimer G3产物(Phe-PL dendrimer G3),从而开发出含有疏水性的苯基的聚合物载体.该产物采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)和¹H核磁共振仪进行分子量和结构的表征.
1 实验部分
1.1 Nα,N*-双芴甲氧羰基赖氨酸的合成
Di-Fmoc-Lysine的合成反应如图1所示.将1g赖氨酸倒入含有20mL二氧六环与水的混合溶剂(体积比为1:1)的三口瓶中赖氨酸，并在冰浴条件下用4mol/L NaOH调节pH至10.0,另称取7g Fmoc-Osu溶于25 mL二氧六环后，滴加进三口瓶，滴加速度为5～10滴/min.反应过程中控制pH在10.0,以确保瓶内无沉淀析出；当Fmoc-Osu加入体积超过1/3后，调节pH至8.0～8.5,反应过夜.反应物中加入50 mL乙醚萃取后，弃去乙醚层；水相另加入
50mL乙醚并于冰浴下调节pH至3,振荡萃取后分出醚层；余下水相复用25mL乙醚萃取两次；合并各次乙醚萃取相并于50℃水浴下蒸出乙醚赖氨酸，得白色油状液体；该液体经乙酸乙酯和石油醚重结晶，冷冻干燥，可得白色粉末3.87 g,收率95.77%.
1.2 PL dendri mer G3的合成
本文采用HOBDIC固相多肽合成技术制备得到了3代树枝状聚赖氨酸 赖氨酸，合成步骤如图2所示·多肽合成仪为自制的50mL梨形三颈瓶.0.5g经DCM溶胀Fmc Qy-Wang树脂用50%哌啶/DCM脱保护后，用DCM与乙醇洗涤并弃去液相.然后，向其中加入含有Di Fmoc Lysine的DMF溶液和HOB;搅拌30min后加入DIC·反应过程中一NH₂:-COOH:DIC:HOB =1:3:4:1.反应时间为24h,期间采用茚三酮定性显色法监测反应进度·反应完全后的树脂用哌啶/DCM脱保护，再次经DCM/乙醇洗涤后，弃去液相.重新加入新的Di-Fmoc-Lysine的DMF溶液重复上述步骤合成第2代聚合物.如此重复两次最终合成连接在树脂上的3代聚赖氨酸(Wang树脂-Gly-Lys-(Lys)₂·(Lys)₄-(Fmoc)₈).该聚合物继续用于后续的表面功能化反应.作为对照的3代聚赖氨酸，可通过上述反应得到的Wang树脂用50%的TFA/DCM进行切割旋蒸，然后冲入乙醚，析出白色粉末；该乙醚溶液静置冰箱里过夜，使沉淀充分；离心并收集沉淀，用乙醚洗涤离心3次，冷冻干燥，可得树枝状聚赖氨酸的3代化合物.第2、3代反应时间分别为2天和3天.
1.3 PL dendrimer G3的表面功能化
反应合成的连接于Wang树脂上的3代聚赖氨酸用哌啶/DCM脱保护并经DCM/乙醇洗涤后，弃去液相.然后，加入Fmoc-Phe的DMF溶液和HOBt;搅拌30 min后加入DIC.反应过程中Wang树脂表面氨基与Fmoc-Phe的摩尔比为1:3.反应程度采用茚三酮定性显色法检测.脱保护和聚合物切割步骤同1.3所述.最终收率为58.7%赖氨酸。
1.4 聚合物的表征
在本文的研究中赖氨酸，Di-Fmoc-Lysine采用Thermo公司LCQ Advandge MAX型离子井质谱检测；聚合物分子量采用Bruker公司Biflex IⅢ型MALDI-TOFMS分析，分析过程中采用α-氰基-4-羟基肉桂酸为基质.¹H-NMR分析分别在Bruker公司AV400核磁共振仪和Varian Mercury VX300核磁共振仪上完成.
2 结果与讨论
2.1 Di-Fmoc-Lysine合成与表征
虽然目前Di-Fmoc-Lysine已有商品化产品，但很少见到其合成方法的公开文献报道.由于赖氨酸的α-氨基和ε-氨基具有不同pK赖氨酸。值，因此本文通过控制反应体系的pH值，使酰化试剂Fmoc-Osu依次与α-氨基和ε-氨基反应获得Di-Fmoc-lysine.反应后用有机溶剂萃取除去过量的Fmoc-Osu,酸化后再用有机溶剂萃取得到比较纯净的产物，然后再重结晶纯化产品.本实验中采取滴加的方式加人Fmoc-Osu是为了减少其在碱性条件下水解带来的影响，以提高反应收率，节省原料.
图3为Di-Fmoc-Lysine产品的¹H-NMR(以DMSO-d₆为溶剂)图谱赖氨酸，各质子峰的位置(δ)为：1.18(y-H),1.36(δ-H),1.63(β-H),2.97(e-H),3.9(a-H),4.2～4.3及7.3～7.9(Fmoc-H).上述各氨基酸对应的质子峰位置与文献报道相符,Fmoc基团的结果与标准图谱的位置一致.利用¹H-NMR结果进而可以考察酰化试剂Fmoc-Osu与赖氨酸的反应程度.图3中赖氨酸β-,γ-和δ-氢原子数量为6,相应的质子峰面积之和为2.97;而Fmoc上氢原子总数为22,相应的质子峰面积为11.98.利用该¹H-NMR结果，通过比较质子峰面积可知，赖氨酸的e-氨基和α-氨基已经完全被Fmoc所保护，反应是完全的.
同时赖氨酸，Di-Fmoc-Lysine的ES-IT MS结果显示，在m/z=613.4的位置有明显质谱峰，其对应于[M+Na]*,而在m/z小于613.4范围内无明显质谱峰出现.这说明得到的产物中赖氨酸的α-氨基和e-氨基均被Fmoc基团保护.将所收集的产物真空干燥后，测得产物的收率在95%以上，与NMR结果相符.
2.2 PL dendrimer G3及衍生物的合成与表征
考虑到空间位阻效应的影响赖氨酸，树枝状聚赖氨酸的合成多采用液相合成方法进行.但其造成产物的分离繁琐并影响到产物的收率(3).基于合成产物的不同，在合成过程中引入聚合物分子为载体可以在一定程度上简化分离步骤.考虑到固相多肽合成法便捷的后处理过程，因此本文用该方法合成3代树枝状聚赖氨酸，从而使各步产物的合成更加简单.各次缩合反应结束后，直接洗涤Wang树脂以除去反应的副产物和过量的原料.实验过程中，树脂的洗涤和氨基脱保护步骤与文献一致.操作过程中，溶液中残留氨基酸和Fmoc采用紫外分光光度计分别于267和300 nm下检测.
反应合成的Fmoc PL dendri mer G3从树脂上切割后赖氨酸，直接进行H-NMR分析，结果如图4(a)所示·图中所对应的质子峰的位置分别为1.0～1.7(γ-,δ-,β-H,Lys),2.97(ε-H,Lys),3.78(α-H,Gly),3.9 α-H,Lys),4.2～4.3及7.3～7.9Fmoc-H.该聚合物所对应的MALDI TOF质谱检测结果如图5(a)所示，其中mlz值为2776.68和2791.62处分别对应为[M+Na]及[M+K] 峰.从质谱的分析中，可以看出Fmoc PL dendri mer G3分子只有一单一的峰，说明该聚合物是单分散性的.
在Wang树脂上合成的Fmc PL dendri mer G3经过脱保护后赖氨酸，进而与Fmc Phe反应合成产物Phe PL dendi mer G3.位于树脂上的该产物经脱保护和切割后得到产品.Phe PL dendi mer G3的'H-NMR结果如图4(b)所示·图中所对应的质子峰的位置分别为1.0～1.7(Y-H,δ-H,β-H),2.97(ε-H),3.21(β-H,Phe),3.78(α-H,Gly),3.9(α-H,Lys),4.08～4.29(α-H,Phe),7.2～7.4(Benz-H,Phe)·图中苯丙氨酸的化学位移是与文献相吻合的.产物该所对应的MALDI TOF质谱检测结果如图(b)所示，其中m/z值为2150.4和2173.6处分别对应为[M+H]及[M+Na]峰.而m/z值为1946.2所对应的是产物缺失了Gly和Phe各一个所引起的·从MALDI -TOF质谱结果可以判断，Phe-PL dendri mer G3产物亦具有非常窄的分子量分布·这就为Phe PL dendri er G3作为基因治疗载体提供了较好的前提.
综上所述赖氨酸，本文以芴甲氧羰基赖氨酸作为支化单元采用固相多肽合成法制备出树枝状聚赖氨酸，并在此基础上通过表面功能化获得了Phe PLdendi mer G3.该产物的制备过程反应条件温和，操作简便且后续处理便捷，产物收率较高(达到50%以上)·合成的产物采用¹H-NMR以及MALDI-TOF质谱进行了表征·质谱的结果表明利用该方法得到的产物分子量单一，是一种潜在的理想非病毒治疗载体.
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